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REAÇÕES DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

As reações imunológicas que envolvem a ligação antígeno-anticorpo podem ser visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes marcadores para o antígeno ou para o anticorpo.

 

Entre os marcadores mais comumente empregados, podemos citar:

  • fluorocromos
  • enzimas
  • compostos radioativos e eletro-opacos.

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Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas. Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC).

 

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Anticorpo: Para visualizar um antígeno de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai reagir com um epítopo do antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo.

 

 

Anticorpo primário

  • Policlonal: quando reconhece mais de um epítopo
  • Monoclonal: quando reconhece apenas um epítopo da proteína.

 

SOROS POLICLONAIS

Os soros policlonais possuem anticorpos produzidos por vários plasmócitos, reagindo com diversos epítopos de um antígeno. 

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O animal mais utilizado para a produção de soros policlonais é o coelho, mas podem ser utilizados cabra, porco, ovelha ou rato.

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O anticorpo secundário é um anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Se foi utilizado um anticorpo primário anti um antígeno de interesse, produzido em camundongo, será utilizado um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo, que reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo.

 

  • Fluorescência - Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser
  • Fluorocromos - É o componente de uma molécula que faz com que esta seja fluorescente

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Os primórdios da imunofluorescência datam de 1942, quando Albert Coons et al. demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos com fluoresceína no tecido pulmonar.

 

 

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The Nobel Prize in Chemistry 2008

Martin Chalfie     -    Roger Y. Tsien     -   Osamu Shimomura

 

Descoberta da proteína verde fluorescente (GFP - Green Fluorescent Protein), fundamental para tornar visíveis os processos da biomedicina. Esta proteína foi observada pela primeira vez nas medusas.

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Com esta proteína, os cientistas conseguiram tornar visíveis uma série de processos, como:

  • o desenvolvimento de células nervosas no cérebro
  • a propagação das células cancerígenas
  • a observação das células que produzem insulina no pâncreas de um embrião
  • a deterioração das células nos pacientes com Alzheimer.

 

A Fluorescência é um processo onde um elemento chamado fluorocromo absorve energia na forma de espectro luminoso, tornando-se eletricamente “excitado”. Ao liberar essa energia, emite luz num comprimento de onda específico.

 

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Os fluorocromos mais utilizados são:

  • isotiocianato de fluoresceína (FITC), de cor verde, que tem um pico de absorção de 490l e de emissão de 520l.
  • rodamina, de cor vermelha, possui picos distintos de absorção e de emissão (520l e 610l).

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Existem três formas distintas de fluorescência:

Específica: deve-se à reação entre o substrato e a proteína marcada com o fluorocromo (reação antígeno-anticorpo).

Não específica: deve-se à coloração dos tecidos por corante livre ou proteínas fluoresceinadas, ou ambos.

Após os fluorocromos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior.