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MICROSCOPIA CONFOCAL

 

 

O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para promover a excitação dos fluoróforos.

Por meio de um conjunto de lentes o microscópio é capaz de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra a ser estudada.

 

“baseia-se na iluminação por varredura a laser, ponto-a-ponto, de um espécime biológico normalmente tratado ou marcado com compostos fluorescentes."

 

Microscópio Confocal

 

Mudando-se o ponto focal, mantendo a profundidade, é possível iluminar todo o plano em estudo, ponto a ponto.

Ao retornar pelo mesmo caminho óptico, a luz é separada utilizando-se um conjunto de espelhos chamados divisor de luz.

Em seguida a luz separada passa por um pequeno orifício, chamado pinhole, capaz de separar apenas a luz proveniente do ponto focado, eliminando a luz emitida por pontos fora de foco.

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Com isso só a luz dos pontos em foco é registrada, com a ajuda de tubos fotomultiplicadores.

Estes sinais gerados pelas fotomultiplicadoras são processados por um computador e, assim, as imagens bidimensionais, extremamente precisas, podem ser construídas.

 

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As imagens capturadas pelo fotomultiplicador selecionam um comprimento de onda por vez, com apenas uma cor a cada imagem.

A união de diferentes cores sobrepostas permite inferir que as estruturas marcadas interagem entre si.

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A microscopia confocal é uma técnica de imagem óptica superior a microscopia óptica convencional porque possibilita:

  • Controle da profundidade de campo
  • Eliminação de informações fora de foco da imagem comprometendo sua qualidade
  • Coletar secções ópticas que podem ser reconstruídas tridimensionalmente.
  • Escaneamento à laser com leitura precisa do plano focal individual de interesse.
  • Múltiplas aquisições de fluorescências: vários fluorocromos que marcam diferentes estruturas celulares, componentes da matriz extracelular ou ainda materiais sintéticos e estruturas particuladas.
  • Localização, coexistência, compartimentalização e co-localização de mais de uma proteína em uma mesma amostra e sua análise gráfica.
  • Análise de amostras tridimensionais, tais como: células tronco, embriões, biofilmes, colônias celulares, esferas, etc.
  • Representação tridimensional de amostras (x-y-z).

 

Exemplo de imagem obtida no laboratório:

Corte Transversal de risoma de Convallaria Rizoma (Fast Green e Safranina) 

 

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Imagem tridimensional produzida a partir da amostra a cima.